在PCR反應(yīng)中，將待擴(kuò)增的DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶等成分加入96孔反應(yīng)板的每個(gè)孔中，然后放入96孔PCR儀中，按照預(yù)設(shè)的程序，依次在高溫下使DNA變性解鏈為單鏈，在較低溫度下引物與模板DNA結(jié)合(退火)，再在適宜溫度下DNA聚合酶催化引物延伸合成新的DNA鏈。經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。
 

　　除了常規(guī)PCR的基本原理外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀在反應(yīng)體系中加入了熒光基團(tuán)。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比。通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，就可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量分析。
 

　　96孔PCR儀的測(cè)定步驟：
 

　　1.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
 

　　-試劑與樣品準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)所需的各種試劑，如DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等，并確保其質(zhì)量和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，準(zhǔn)確計(jì)算和配制反應(yīng)體系，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以?xún)?yōu)化反應(yīng)條件。
 

　　-器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好干凈的光學(xué)級(jí)封板膜、移液器及配套的吸頭等。確保PCR板無(wú)劃痕、無(wú)污染，封板膜密封性良好。
 

　　2.加樣
 

　　-加樣操作：將配制好的PCR反應(yīng)體系依次加入96孔PCR板的各孔中，注意移液器的使用技巧，避免氣泡產(chǎn)生，并確保每個(gè)孔中的樣品和試劑量準(zhǔn)確且一致。在加樣過(guò)程中，要嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，避免交叉污染，每次更換樣品或試劑時(shí)都要更換移液器的吸頭。
 

　　-封板：加樣完成后，用光學(xué)級(jí)封板膜將PCR板密封好，防止PCR過(guò)程中的蒸發(fā)和污染，確保每個(gè)孔中的反應(yīng)體系在相同的條件下進(jìn)行。封板時(shí)要注意撫平封板膜，避免產(chǎn)生氣泡，影響熒光信號(hào)的檢測(cè)。
 

　　3.放置樣品：將密封好的96孔PCR板輕輕放入PCR儀的加熱孔中，確保PCR板與儀器的接觸良好，位置擺放正確。
 

　　4.設(shè)置程序：打開(kāi)PCR儀的電源和配套的軟件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置熱循環(huán)程序文件，包括預(yù)變性溫度、時(shí)間，變性溫度、時(shí)間，退火溫度、時(shí)間，延伸溫度、時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等參數(shù)。同時(shí)，設(shè)置反應(yīng)板文件，對(duì)各孔進(jìn)行標(biāo)注，以便區(qū)分不同的樣品。